发布时间：2017/7/14 13:51:40 阅读次数：1596
概述
Engvall和Perlmann于1971年首先建立了酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）。随着科技的发展，ELISA在抗原、抗体、酶、固相载体及包被技术等方面都有较大的进步，其灵敏度和特异性均大大提高。由于该技术具有简便、快速、经济等特点，因而已被广泛应用于各行业。尽管如此，ELISA在应用过程中仍然存在着许多难点，必须严格控制才能保证检测的质量。
ELISA质量保证是一个复杂的过程，许多重要的环节都影响到检测的质量。现分述如下：
一、方法学的影响
ELISA测定模式包括以下几种：双抗体夹心法、间接法、双抗原夹心法、IgM抗体捕捉法、竞争抑制法，其中竞争抑制法因受操作时差所引起的不公平竞争等因素的影响，结果重复性较差，质量较难控制。
二、试剂因素
1.试剂的选择
免疫检测的原理均基于抗原抗体反应。由于该反应过程受多种因素的影响，如普遍存在基质效应、交叉反应等，因而检测结果难以溯源，不同方法、不同试剂之间甚至同一试剂不同批号间结果均缺乏可比性。试剂质量在很大程度上决定了检测的水平，因此在引入新项目之前必须对试剂进行严格的评估。试剂的评估有以下几个步骤：⑴确定开展该项目的必要性；⑵了解该项目现有的检测方法和原理；⑶在了解试剂的组成基础上选择多家试剂盒进行比较，判断标准首选参考方法或参考物质，其次为临床的满意度及权威机构的报告如各级室间质量评价、CDC报告等；⑷定期对检测结果进行追踪反馈直至最终认可该试剂。
2.试剂的准备
不同批次的ELISA试剂在制作过程中很难保证质量完全一致，即使是通过批批检的项目其检测结果也存在差异，因此必须选择和订购长批号的试剂，并保证保存条件。严格执行这一标准可以避免因试剂批号改变而重新建立质控体系及重新评估试剂的复杂过程，并且能够保证结果的稳定性；对于效期短、使用率低的试剂，应当小量分装，每次使用则取分装部分即可，避免反复冻融造成试剂的失效。
试剂使用前必须平衡至室温，否则会影响检测下限。未用完的室内质控品及本次不需使用的试剂应密封并及时放回冰箱保存。
三、样本因素
标本干扰因素包括内源性干扰因素和外源性干扰因素，前者包括类风湿因子、补体、异嗜性抗体、自身抗体、溶菌酶等，后者包括标本溶血、标本被细菌污染、标本贮存时间过长、标本凝固不全、冷冻标本的反复冻融等。其中外源性干扰因素是我们在检测过程中可以避免也是必须避免的因素，而避免内源性因素的干扰则主要通过选择合适的试剂盒。在临床中遇到少见的疑难病例时应当考虑到内源性干扰因素的存在。以下对外源性干扰因素进行简要说明：
1.标本溶血 要注意避免出现严重溶血。血红蛋白中含有血红素基团，其具有类过氧化物的活性，因此，在以辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase,HRP）为标记酶的ELISA测定中，如果血清标本中血红蛋白浓度较高，则其就很容易在温育过程中吸附于固相，从而与后面加入的底物反应显色。
2.标本被细菌污染 标本的采集及血清分离要注意尽量避免细菌污染。细菌菌体中除可能含有内源酶对测定产生非特异性干扰外，还可能对抗原抗体等蛋白产生分解作用。另外标本在保存中出现浑浊或絮状物时，应离心沉淀后取上清检测。
3.标本贮存时间过长 标本在低温下保存时间过长，IgG可聚合成多聚体，在间接法ELISA测定中会导致本底加深、甚至出现假阳性结果。通常情况下血清标本可在2～8℃下保存l周，冷冻保存时间会更长，但对于抗体或抗原含量低的标本而言，则可能会因抗体掉价、抗原分解而出现假阴性结果。
4.标本凝固不全 血液通常在采集后半小时后开始凝固，18～24h完全凝固。如果在血液未凝固时即离心分离血清，则可因纤维蛋白原非特异吸附于微孔而造成假阳性结果。为了缩短标本处理时间，可以在离心前将血液标本置于温箱中温育或者采用带分离胶的采血管或于采血管中加入适当的促凝剂以加速血清的分离。
5.冷冻保存标本避免反复冻融 标本的反复冻融会因其所产生的机械剪切力对标本中的蛋白等分子产生破坏作用，使抗体效价跌落从而引起假阴性结果，所以测抗体的血清标本如需保存作多次检测，宜少量分装冻存。此外，标本在冻存时会因蛋白质局部浓缩，分布不均，因此重新融解的标本必须混匀，但不要进行剧烈振荡，反复颠倒即可。
四、操作因素对ELISA结果的影响
ELISA测定一般遵循以下步骤：固相包被→加样品→温育→洗涤→加酶结合物→温育→洗涤→加底物→温育→显色→终止显色→比色
目前各种形式的ELISA自动分析仪已经进入市场，如广泛应用于血站系统的微板式全自动酶免分析仪，其试剂为开放式的，而对于其它类型的仪器，则试剂和仪器往往是配套的。但当前大部分医学实验室均采用手工操作加仪器测定的方式。ELISA操作步骤复杂，操作不当将引起较大的误差。以下叙述各个步骤中的影响因素。
1.加样
加样器是一种比较精密的工具，其在长时间使用时会因机械磨损或者推动杆内附着血痂等原因造成加样不准，尤其是对于样本量较大的临床实验室，因此必须定期对加液器进行维护和校准。每次加不同的标本时均需更换吸嘴，以免发生交叉污染。加样时速度不可太快，避免将标本加在孔壁上部 ，并注意不要溅出或产生气泡。加样时还应当注意操作时差对结果的影响，操作时差是指加入标本、试剂及混匀时间的差异。操作时差在每个实验中都存在，尤其是手工操作，日常检测标本多达几百个，从加入第一个标本到最后一个标本，需几十分钟，加入试剂及混匀等均存在着前后的时间差异，使抗原抗体反应和酶促反应时间不一致，操作时差对竞争法检测的结果影响更大，在加酶结合物和底物时可用定量多道加液器，使加液过程迅速完成。如果使用滴瓶除注意滴加的角度外还要注意滴加的速度，速度太快，容易出现重复滴加或者加在两孔之间，造成非特异性吸附。另外有些项目在检测前需要稀释以减低非特异性反应，但稀释的方式非常重要，如果采用手工稀释则容易因操作者个体差异而产生不一致的结果，尤其是吸光度处于临界值附近的标本，因此最佳的方式是采用振荡器混匀。
2.温育
在 ELISA检测中一般有两次抗原抗体反应，即加标本和加酶结合物后�？乖固宸从Φ耐瓿尚枰幸欢ǖ奈露群褪奔�，这一保温过程称为温 育(incubation)。
温育常采用的温度有 43℃、37℃、室温和4℃（冰箱温度）等。37℃是实验室中常用的温育温度，也是大多数抗原抗体结合的最适反应温度。有实验表明，抗原抗体反应一般在37℃经1～2小时产物的生成可达顶峰。为加速反应，可在一定范围内提高反应的温度并在反应过程中连续振荡以增加抗原抗体接触的机会�？乖固宸从υ�4℃反应更为彻底，形成的产物更多更稳定，但因所需时间太长，在ELISA检测中一般不予采用。
温育的方式有温箱法、微波辐射法、水浴法等，其中水浴法能较好解决因受热不均衡所致的周围孔与中央孔结果的吸光度差异（这种现象被称为“边缘效应”）。若用温箱温育则ELISA板应放在湿盒内，湿盒要选用传热性良好的材料如金属等，在盒底垫湿的纱布，最后将ELISA板放在湿纱布上。采用这种温育方式的关键是必须保证湿盒内的温度达到反应的要求，可在反应前将湿盒预温至规定的温度，并用温度计监测反应过程。采用水浴时，将ELISA板置于水浴箱中，板底贴着水面。为避免蒸发，板上应加盖或用塑料贴封纸或保鲜膜覆盖板孔，此时可让反应板漂浮在水面上。温育过程中，反应板不宜叠放，以保证各板的温度都能迅速平衡。严谨的ELISA试剂盒一般都规定了明确的温育温度，若要求室温温育，则一般是指20～25℃。微波辐射法能缩短温育时间，但不能解决“边缘效应”，因而较少使用。
3.洗涤
洗涤是ELISA测定过程中决定实验成败的一个关键步骤。其目的是去除反应体系中与反应无关的成分、未结合的酶结合物以及反应过程中非特异性吸附于固相载体的干扰物质。由于抗原和抗体的包被通常是在碱性条件下与固相的疏水键相互作用而被动吸附于其上的，因此必须注意非离子去垢剂的使用浓度，最常用的洗涤液是含0.05％吐温20的0.02mol/L， pH 为7.4的 PBS液，如果洗涤液中的吐温20超过 0.2％，可使包被于固相上的抗原或抗体解吸附而影响实验的测定下限。
洗涤可采用洗板机或手工洗涤两种方式，手工洗板则分为浸泡式和流水冲洗式洗涤。无论洗板方式如何，在向板孔内注液时应当避免气泡残留孔内，否则会因洗涤液难以进入孔中而影响洗涤效果。在采用洗板机洗板时，一定要将板条平放于板架上，保证洗板机上的每个吸液针都能一致地插入板孔底部将洗液完全吸净，否则空白值将升高甚至出现“花板”现象（背景不干净），造成实验失败，尤其是当酶结合物非特异吸附而残留于板孔时。若采用手工洗板，则可在每次弃去板孔内液体后将反应板于布料上拍干，布料可在消毒洗涤后重复使用。
手工洗板一般为3～5次，使用洗板机洗板时，其所需次数可通过以下实验确定：选择8×12 HBsAg ELISA包被板条，在每孔中平行加入相同的一份弱阳性血清，按试剂盒说明加入酶结合物并完成温育，洗板机设置如下：第1次洗涤1排、第2次洗涤2排、第3次洗涤3排……直至8次洗涤8排，每次只洗涤1遍，其结果是第1排洗涤了8遍，第2排洗涤7遍……第8排洗涤1遍，加底物显色后，根据吸光度值不再改变的反应条的洗涤次数来确定最佳的洗板次数，例如第3排反应条吸光度值不再改变，则认为该项目最佳洗涤条件为6遍。另外有三方面必须注意：一是在使用洗板机洗板时，通常在上机前应先将反应液弃去并用流水快速冲洗1遍，避免因反应液对洗板机管道污染而造成的交叉污染和背景颜色加深，但对于粘性大的稀释液或反应液而言，则需直接上机洗涤，并增加洗板后清水冲洗管路的次数；二是对于两步法而言第一步洗涤次数不宜太多，否则将降低结果的吸光度值。
4.显色
显色是 ELISA中的最后一步温育反应，在以HRP作为标记酶的ELISA试剂盒中，主要采用TMB和OPD两种底物，其中以TMB最为多见，TMB底物显色一般要求室温或37℃反应15～30分钟。研究表明，显色受时间和温度的影响，一般37℃反应30分钟可使显色充分，如果缩短反应时间或者降低反应温度均可影响检测的下限。为了保证结果的稳定性，必须固定显色时间和温度，但不少操作者往往忽略了这一点。TMB显色体系的A液和B液可在使用前先混合然后用排枪加入反应孔中，这样既节省人力又缩短了操作时差对结果的影响。反应液应新鲜配制并且避免接触金属器皿，否则可因氧化等原因产生颜色反应。OPD由于其具有致癌性目前已很少使用。
5.比色
ELISA显色的结果必须通过酶标仪进行检测，有两个重要的原因：一是不同的个体的色觉存在差异，如果仅凭肉眼判断，则结果重复性差，并且难以形成统一的判断标准，尤其是对于HBeAb、HBcAb这样的检测项目；二是日益频繁的医疗纠纷要求临床实验室必须对ELISA检测的原始吸光度值，阴阳性判断结果等原始数据进行保存，否则面对医疗纠纷时将无法举证。
TMB的终止液有多种，叠氮钠和十二烷基硫酸钠（SDS）等酶抑制剂均可使反应终止，各类酸性终止液则将蓝色转变成黄色。有实验表明，从终止反应后2分钟开始，样本的吸光度值逐渐下降，起始吸光度值越高其下降速度越快，为保证实验结果的稳定性，宜在终止反应后2分钟内读取吸光度值。
酶标仪应采用双波长进行测定，必须包括对颜色产物敏感和不敏感的两个吸收峰波长，在非敏感波长处测定特异性显色的吸光度值接近为零，此时测的吸光度值为容器上的划痕、指印、背景等造成的光干扰。以TMB底物为例，其最大吸收的波长为450nm，非敏感波长为630nm，双波长检测最终得到的吸光度值为两者之差。双波长测定能去除背景的干扰，一般不设空白孔，否则会出现吸光度值为负值的现象。
酶标仪的使用需强调仪器的维护和保养，酶标仪首先应放置通风处，避免机器内部尤其是滤光片发霉，在使用过程中避免酸等物质溢出腐蚀仪器，每半年或一年请计量局对酶标仪进行检定，并请厂商定期维护。比色前应先用洁净的吸水纸拭干板底附着的液体。酶标仪在使用前应先预热15～30分钟，测读结果会更稳定。
五、灰区的设置
通常情况下，ELISA定性实验以“阳性”和“阴性”来报告结果，两者间有一条分界线被称为“阳性判断值”（cut-off value，CO值），这是定性免疫测定结果报告的依据。由于ELISA CO值的设置不能区分所有正常和异常的人群，尤其是位于CO值附近的人群，并且ELISA检测具有以下几个特点：检测变异大（18%～65%）；不同试剂盒CO值存在差异；病毒感染存在窗口期；病毒变异后表达产物含量低以及个体差异等，因此在CO值附近存在一个临床意义可疑的的区域被称之为“灰区”，在国内的传染性病原体抗原和抗体检测的ELISA试剂盒中均未涉及“灰区”的设置，但仅仅依靠CO值来决定感染的有无，尤其是对献血员的筛查具有较大的风险。因此对于检测结果位于“灰区”的病人可采用确认实验或追踪检测的办法加以确诊。
目前“灰区”的设置有二种方式：⑴CO×（1±CV）， CV为该试剂的批内CV (一般在15-20%)；⑵CO±2s，s为实验室做室内质控ROC（常规条件下的变异）的标准差。
六、标本复查
ELISA手工检测过程复杂，影响因素较多，即使室内质控在控，也可能因孔间差异而造成结果的差异，因此加大复查力度是保证结果准确性的可靠方法，比如对HBsAg、HBeAg、HCV-Ab、HIV-Ab、TP-Ab等项目的可疑、弱阳性标本及少见模式的检测结果进行复查。
复查方式主要有两种：一是采用同一种试剂复查，理由是市售试剂均通过国家食品药品监督管理局（SFDA）认可，严格按照其说明书操作，检测结果具有法律效应，若使用不同的试剂（非确证试验）复查，当结果不相符合时，则最终结果难以判断（免疫检测缺乏“金标准”）。另一种复查方式是采用国外进口试剂进行复查，其理由是尽管进口试剂并不是“金标准”，但实验室已经对此高度重视，并且使用了质量较好，价格较贵的试剂，但该法对于小医院而言则很难实施。
七、结果判断和报告
常用下列几种方法表示结果：
1.定性测定
(1)阳性判定值法(cut-off value，CO)：一般为阴性对照的平均A值加一个常数，试剂制备、检测过程必须严格标准化，要先计算出阳性对照A值平均数和阴性对照A值平均数。标本A值≥阳性判定值为阳性。阳性判定值公式中的常数是在特定的检测系统中通过对大量标本的实验检测而得到的。现以HIV检测试剂盒为例。NC=阴性质控对照的A值；PC1=抗-HIV-1阳性质控对照的A值；PC2=抗-HIV-2阳性质控对照的A值；NC值的要求：⑴NC必须小于0.250。去掉大于等于0.250的阴性质控对照。⑵计算留下的阴性质控对照的平均值（NCx）。⑶NC必须在0.6NCx和1.4NCx之间。去掉NC小于0.6NCx和大于1.4NCx的阴性质控对照。实验满足下列条件有效：⑴多于半数的阴性质控对照符合要求（一般为1个PC，3个NC）；⑵PC1-NCx≥0.400；⑶PC2-NCx≥0.400(如果使用)。如果实验有效，CO=NCx+0.100,样品A值大于等于CO，判定为有活性反应。样品A值小于CO，判定为无活性反应。根据以上叙述可以看出，在这种方法中阴性对照和阳性对照也起到了质控的作用，试剂变质和操作不当均会产生“实验无效”的后果。由此可以看出为了避免检测结果受单孔阳性或者阴性对照的影响（当参与CO计算时），必须设立多孔对照、合理布局，并限定取舍条件。
(2)S/C（待测标本A值／校准品A值）：S/C≥1.1为阳性，S/C＜0.8为阴性；S/C≥0.8但＜1.1为可疑，反应体系中阳性、阴性对照及校准品检测的吸光度必须落在规定的范围内，结果才有效。
(3)S/N值法(待测标本A值／阴性对照A值)或S／Co值法：通常S／N≥2．1 ，S／Co≥1为阳性。
(4)抑制率法：在竞争抑制法中结果可用抑制率表示。抑制率（％）＝（阴性对照A值-标本A值）/阴性对照A值×100%，一般以抑制率≥50%为阳性。
2.半定量测定 结果一般以滴度表示。将标本连续稀释后，进行ELISA检测，在阳性临界值以上的最高稀释度即为该标本的“滴度”。
3.定量测定 即用已知量的标准品作一系列稀释后进行ELISA测定，绘制标准曲线，结果以绝对量或单位表示。在ELISA定量检测中每一块反应板都必须绘制相应的标准曲线。
4.结果报告
传统的ELISA结果只报告“阳性”或者“阴性”，但不能解决“灰区”的问题，因此引入“可疑”的报告方式是比较合理和科学的，同时对结果做必要的说明，如“结果已经复查，建议定期复查或定量检测”；对于HBeAb、HBcAb检测，由于各试剂盒CO值差异及变异系数大等因素，结果缺乏可比性，位于CO值附近的标本复查结果阴阳性只是概率事件，另外HBcAb存在原倍和1：30检测模式及定量检测模式，报告结果的不一致对于临床实验室来说是不可回避，也是目前医疗纠纷主要集中点和“结果互认”的最大障碍，因此在减小室内变异的同时必须引入阳性和弱阳性的报告方式。
八、原始记录
ELISA检测结果变异大，不同体系难以溯源，因结果不一致而引起的医疗纠纷逐日增多，因此ELISA检测的原始存根必须完整而全面地保存，包括布局，原始吸光度值，检测的阴阳结果，检测者，试剂厂家，批号，质控品来源及批号等。严禁人为修改检测结果。
九、质量控制
1.室内质量控制（室内质控）
ELISA定性试验的临床意义在于是否检出病原体，与检出量无关，因此质量控制（quality control, QC）要保证试验的灵敏度和重复性。目前定性实验的质控规则还还存在争议，目前有以下几种比较流行的理论：
⑴室内质控品
室内质控品的稳定以及合适的浓度是运用一切质控规则的前提�？裳≡馭/CO值减去精密度测定中得到的三倍批间CV%（通常的ELISA测定批间变异（CV%）在15%左右）与该S/CO值的乘积（意即三倍SD）仍大于1的质控血清作监测重复性的室内质控品用。 计算公式：S/CO（1-3CV%）=S/CO-3SD。同时选择S/CO处于1.5左右的质控血清以判断每次测定时试剂盒测定下限的有效性。
⑵ “即刻性”质控
一些实验室不是每天进行ELISA项目的检验，而ELSIA部分试剂盒效期短 ，用同一批号试剂盒连续常规测20次，难度较大。采用"即刻法"质控统计方法，只需连续测3次，即可对第3次检验结果进行质控。①先将测定值从小到大排列，X1最小，Xn最大 ；②计算X和s；③计算SI上限值和下限值。SI上=（X最小-X）/S，SI下=（X最大-X）/S；④对照SI表，检查是否出控。SI上、下限≤规定值，在控； SI上或下限>规定值，失控。
⑶Levey-Jennings质控图结合Westgard多规则质控方法 Levey-Jennings质控图以及Westgard多规则质控方法最早应用于生化检测的质量控制，在ELISA检测中仍为探索阶段，一般认为：①一 次超出3SD；②连续二次超出2SD；③3～5次连续处于一侧的2SD之内；④5～7次连续偏向横轴的一侧，均为失控。目前多采用一次超过2SD作为“告警”，一次超出3SD为“失控”。
另外还有Westgard多规则质控规则、累积和（CUSUM）质控规则等质控方法。
⑷卫生部临床检验中心确定的质控方法：
室内质控品：定性测定的室内质控品，除了试剂盒附带的阴阳性对照外，实验室还应该选择至少2个室内质控品，其中一个为弱阳性质控品，接近Cutoff值，S/Co值应该为2～4之间；另一个为阴性质控品。定量测定则至少要求一个水平的质控品。
测定频度：每台仪器，每次检测患者样本时至少测定一次室内质控品；ELISA测定每块板都要测定室内质控品。
质控图绘制：定性测定可采用弱阳性质控品的S/Co值作质控图。定量测定参照临床化学的绘制方法。质控判断规则：定性测定为弱阳性的质控品不能测定为阴性；阴性质控品不能测定为阳性。重复性的判断规则为12S（警告限），13S为失控限。定量测定参照临床化学的判断规则。
⑸室内质控的现状及应对措施
免疫质控品制作困难，不管是自制血清或者购于其它机构，其稳定性和浓度很难达到要求，加之ELISA影响因素较多，失控后很难找到确切的原因。因此如何开展ELISA室内质控一直困扰着临床检测者。基于此，不同实验室采取了不同的应对措施，举例如下：①选择卫生部临床检验中心（NCCL）的低值质控血清作为室内质控品，储备量以3个月，采用一次超过2SD作为“告警”，一次超出3SD为“失控”的质控规则，（但该法对于HBeAb（4NCU/ml）、 HBcAb(2NCU/ml)检测不适用，因为即使质控在控，其结果也可能为阴性）；②由于质控品不稳定，每个月需重新设立靶值 ，并根据常规CV设定SD（SD= ×CV¯）；③阴阳性对照正常，室内弱阳性和阴性质控正常，且没有出现“花板”（洗板不干净，背景颜色深）的情况下认为该检测批有效，但仍需对位于“灰区”和弱阳性的HBsAg、HBeAg结果及少见模式结果进行复查，避免偶然因素及孔间差对结果造成影响；④若阴阳性对照、阴性质控异常，或出现“花板”的情况则必须整批复查；⑤在阴阳性对照、阴性质控正常且未出现“花板”的情况下，弱阳性质控S/Co超出-3SD时复查位于“灰区”标本，超出+3SD时则复查弱阳性标本；⑥对于抗体检测，尤其是竞争法检测HBeAb、HbcAb，由于不同试剂盒、不同检测方法间CO值存在差异及变异系数大等因素，结果缺乏可比性，失控后的处理很难满意地解决，在没有统一的判断标准、较小的变异系数及明确的临床意义的情况下，引入弱阳性报告方式在临床实践中证明可行；⑦室内质控的评价：认真分析每一次室内质控失控的原因，并对各项检测的均值，CV等进行月与月之间的比较分析，及时发现试剂盒检出能力的变化及操作中存在的问题，并采取适当的措施来提高检测的精准性。
2.室间质量评价（室间质评）
室间质评是一种回顾性评价，主要是控制实验结果的准确性，也是某些定量实验量值的溯源。作为临床实验室应当积极参与各级室间质评计划，其要点是保证同病人标本一样对待室间质评物。必须强调的是室间质量评价结果必须同室内质控一并分析，查找原因以期改进工作中的不足，同时指导实验室选择合适的试剂盒。
十、免疫检验存在的问题
HBV基因组变异对病毒HBsAg和HBeAg测定影响问题，以及如何评价试剂盒对这些变异株的检测效能；HBcAb检测在保证输血安全中的意义；HBeAb、HBcAb溯源性问题；HBcAb检测模式的问题等均困扰着临床检测者。
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[4] 李金明. 乙型肝炎病毒血清标志物测定及结果解释的若干问题. 中华检验医学杂志，2006，29（5）：385-389.
[5] 卫生部临床检验中心，中国医院协会临床检验管理专业委员会. 《医疗机构临床实验室管理办法》及配套文件，2006：10-11.
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